ELISA雙抗夾心法操作步驟：

ELISA實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）。試劑或樣品稀釋時，確保混勻，同時盡量避免起泡。

1.包被抗體：用碳酸鹽緩沖液（CBS）或者磷酸鹽緩沖液（PBS）根據(jù)實驗需要，將包被抗體稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃過夜。

2.洗板：棄孔內液體，甩干，10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內液體拍干）。

3.封閉：含1% BSA或者5%脫脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封閉液，350-400μl/孔，37℃、2h。

4.洗板：同步驟2。（備注：商品化試劑盒一般已經(jīng)預包被了包被抗體在酶標板上，不需要進行1-4步驟，使用前請注意核實）。

5.加樣：分別設零孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl。（注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，一塊板要在10 min內上完樣品。）酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應60-120min。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

6.洗板：棄孔內液體，甩干，10mM PBST（10mM PBS 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內液體拍干）。

7.加檢測抗體：根據(jù)實驗需要，將檢測抗體用PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。

8.洗板：同步驟6。

9.加二抗：根據(jù)實驗需要，將二抗用10mM PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。

10.洗板：同步驟6。

11.酶標儀讀值：以630nm為校正波長，用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），在加終止液后5min內進行讀數(shù)。

12.結果判斷：

a.每個標準品和樣本的OD值須減去零孔的OD值，如設置復孔，則應取其平均值；

b.以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，使用專業(yè)制作曲線軟件進行四參數(shù)擬合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線推算出相應的擬合濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的測定濃度。