操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿(mǎn)37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

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細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

主要功能：

（1）血管平滑肌細(xì)胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。

（2）表達(dá)鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應(yīng)。

（3）與血管的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)。

 生理變化：

（1）主動(dòng)脈硬化。

（2）主動(dòng)脈瘤

（3）主動(dòng)脈鈣化。

基本特性：

（1）組織來(lái)源于正常大鼠大動(dòng)脈組織。

（2）鑒定：肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。

（3）原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每?jī)龃婀芗?xì)胞數(shù)：>5×105 cells/1ml。

（5）肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗(yàn)證。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。

培養(yǎng)步驟：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2/CCL8)ELISA Kit　EDTA Solution（EDTA溶液）,0.5M,pH8.0

Clostridium cellobioparum medium　人α突觸核蛋白(α-SYN)ELISA Kit

pAG425GAL-ccdB-Cerulean(pAG425GALccdBCerulean)　RCM medium (with sea salts)

人沙眼衣原體抗體(CT)ELISA Kit　pDONR201

Yac-1 [Yac1]細(xì)胞株　小鼠β-防御素(β-DF)ELISA Kit

pLVX-rHom-Nuc1（pLVXrHomNuc1）　DNA電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)系列（DNA marker）（pBR322/MspI）

重蒸酚 pMMB67HE

人頭瘤病毒16,18型PCR檢測(cè)試劑盒　Blocking Reagent with Triton X-100 & Fetal Calf Serum

0.5mL RNase-free離心管　大鼠胰島素受體β(ISR-β)ELISA Kit

L3560　Marine medium with pyruvate

人尿微量白蛋白(ALB)ELISA Kit　pcDNA4/His A(pcDNA4HisA)

NB-4 [NB4]細(xì)胞株　人制瘤素M受體(OSMR)ELISA Kit

pIRES-puro2(pIRESpuro2)（60908-4311）y　柱式質(zhì)粒DNAout(50次)

兔肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞維生素B1 英文名稱(chēng)：Vitamin B1 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

間二酚 英文名稱(chēng)：Resorcinol 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

**泊苷 英文名稱(chēng)：Etoposide 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

夫拉扎勃（原：呋咱甲氫龍） 英文名稱(chēng)：J La Szabo (formerly: furazabol) 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

吡拉西坦 英文名稱(chēng)：Laci Staw 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

豆腐果苷 英文名稱(chēng)：Helicid 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

大蒜素 英文名稱(chēng)：Allicin 規(guī)格：：0.5ml 保存：：-20℃，避光

紫杉 英文名稱(chēng)：Paclitaxel 規(guī)格：：30mg 保存：：-20℃，避光

腎上腺色腙 英文名稱(chēng)：Carbazochrome 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

更昔洛韋 英文名稱(chēng)：Ganciclovir 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

氨力農(nóng) 英文名稱(chēng)：An Linong 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光