實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

PCR反應(yīng)條件的控制：

1.  PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。

2.  鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。

3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。

4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。

6.  反應(yīng)溫度

（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期"。