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單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
日期：2024-09-20 13:43
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摘要：單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。? 1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細(xì)胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細(xì)胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂...
單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：
1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細(xì)胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細(xì)胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強(qiáng)，細(xì)胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細(xì)胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進(jìn)行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預(yù)冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml 的離心管中，離心得細(xì)胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數(shù)次，離心，超聲裂解，離心，取上清）
1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2.每瓶細(xì)胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
4.每瓶細(xì)胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
5.裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）
6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5 ml 的離心管中放于-20℃ 保存。
（個人感覺上述方法可操作性有待加強(qiáng)，細(xì)胞中蛋白本來就很少，一瓶 T-75的細(xì)胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進(jìn)行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。）
（注：先用預(yù)冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，清洗2次，加1ml PBS用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml 的離心管中，離心得細(xì)胞，加裂解液冰上裂解30分鐘期間震蕩數(shù)次，離心，超聲裂解，離心，取上清）